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辅助生殖医学中心装备手册

时间:2013-12-04 23:30 来源:中国试管婴儿网 作者:雷琼 王琼 点击:
辅助生育技术(ssistedeproductiveechnology,)是近几十年来发展起来治疗不孕症的新技术。它是多学科交叉的一个新领域,融合了妇产科、男科、遗传学、组织胚胎学、分子生物学和动物学等多学科的新成果.发展出卵细胞浆内单精子显微注射(ntraytoplasmicpermnject

中山大学附属diyi医院生殖医学中心 雷琼 王琼

辅助生殖医学中心装备手册

  辅助生育技术(ssistedeproductiveechnology,)是近几十年来发展起来治疗不孕症的新技术。它是多学科交叉的一个新领域,融合了妇产科、男科、遗传学、组织胚胎学、分子生物学和动物学等多学科的新成果.发展出卵细胞浆内单精子显微注射(ntraytoplasmicpermnjection,)、胚胎活检等一系列在生命科学领域起重要作用的新技术,当之无愧地成为本世纪最具发展前景的学科之一。

  辅助生殖技术的种类繁多,包括人工授精(rtificialnsemination,)和体外授精一胚胎移植(nitroertil—izationandmbryoransfer.—)以及在此基础上衍生的各种新技术.如卵细胞浆内单精子显微注射、植入前胚胎遗传学诊断(reimplantationeneticiagnosis,)、配子输卵管移植、人类胚胎的辅助孵化(ssistedatching,)、卵子的体外成熟(nitroatu.ration,)、生殖能力的保存相关技术(精子冷冻、卵子和卵巢组织冷冻、胚胎冷冻)等。近年来出现的核移植与治疗性克隆、胚胎干细胞等都属辅助生殖技术范畴。

  辅助生殖技术的迅猛发展有赖于相关仪器设备的支持。为规范辅助生殖技术的运用.我国卫生部制定了明确的《人类辅助生殖技术规范》规定,并不断修订完善,于2003年10月1日起执行的最新规定给出了辅助生殖技术领域的严格准入制度。

  其中最引人注目的是对仪器设备非常具体的要求。如:对开展人工授精技术的单位要求超仪一台(配置阴道探头)、生物显微镜一台、百级超净工作台、二氧化碳恒温箱、液氮罐2—3个,以上设备要求运行良好,专业检验合格对开展体外授精,胚胎移植及其衍生技术单位要求基本专用仪器总投资不少于150万元,要有两台配置超阴道探头和穿刺引导装置超,含恒温平台倒置显微镜及显微操作系统、解剖显微镜、生物显微镜等。对于一项临床治疗技术需要由卫生部制定相应的关于仪器设备方面的准入措施,其在辅助生殖技术中的重要地位可见一斑。

  在辅助生殖技术实施过程中.临床医生为患者制定合适的方案进行超排卵或促排卵后,须利用超声监测卵泡的发育状况,才有机会让患者获得高质量的卵子。而实验室的工作人员也必须依赖良好和先迸的仪器设备,才能为卵子授精和胚胎发育提供一个稳定、无毒和无病原体的环境。人类配子和胚胎的生长和发育对培养条件要求非常苛刻,温度、p值和其他因素可能会在分子水平影响胚胎细胞而且实验室的技术人员必须利用相应的仪器设备才能对配子和胚胎进行各种精细的操作。

  例如:辅助孵化技术需要各种人为的方法来切开透明带,激光打孔仪不可或缺过程中的卵子和胚胎活检需要精细的显微操作还有核移植、卵浆置换都离不开精良的仪器设备。总之,仪器设备优良与否与辅助生殖技术的进展息息相关。

  超声仪——精良视野的提供者

  超声仪是妇产科诊疗活动中不可或缺的工具.在辅助生殖技术中它用途也非同小可,可谓贯穿整个治疗过程。从监测卵泡到介入操作都离不开精确的超声诊断。主要使用的超声仪包括有:经腹超声、阴道超声、阴道彩色多普勒超声。国内常用的机器品牌有:韩国麦迪逊、中日合资阿洛卡、德国西门子、美国通用。

  经腹超声 由线阵或相控阵探头获得,可提供较大范围的图像视野。但需要充盈膀胱才能使声速穿透较深的盆腔结构,充盈的膀胱也有助于将小肠白宫腔及子宫周围推开,使图像更清楚。经腹超声可提供整个盆腔器官在长短袖上的图像.而且显示盆腔主要脏器如卵巢、子宫的结构及其相互关系。大部分线阵探头有时间增益补偿调节以及对检查目标有最佳聚焦。通常在阴道超声前先经腹部超声以描绘整个盆腔结构,使所获得的影像在以子宫和附件为主的区域内。

  经阴道超声 原理是探头使用机械扇扫凸阵探头或相控阵线阵探头。根据阴道解剖特点,需用阴道小接触面探头,由于所探查的结构距探头最近,使用高频率探头(大于5z)的显示效果较好凸阵探头所发出和接受的声束最多,有最佳的声束密度,因而在引导超声较小的图像视野内可提供最详细的信息。此类超声检查可在有限的图像视野内(10cm)提供详细的结构图像。检查时,腹部轻触诊可推开肠袢使图像免受干扰,还可根据盆腔脏器的移动判断是否存在盆腔粘连。辅助生殖技术中使用最为频繁的也正是它,例如:在促排卵用药期间要定期监测卵泡发育,以确定主导卵泡了解子宫内膜生长情况,有助于判断治疗时机对盆腔脏器(如子宫、卵巢)进行监测。值得重点提出的是:超声引导下将穿刺针固定在探头柄上,进行卵泡抽吸、囊肿抽吸以及其他盆腔介入性操作技术,是辅助生殖技术的重要一部分,探头上有一键可提供探头发出的光束作为针导线,针导线清晰地显示在屏幕上,无论用cored针或eflon—oated针沿针导线穿入,在屏幕上都清晰可见。

  经阴道彩色多普勒超声 可描述盆腔解剖图像,同时还可以多普勒频谱彩色像素来显示血流。红色表示血流朝向探头,蓝色表示血流背离探头。较高速血流以亮影显示,探测慢速血流则选用低脉冲重复频率和典型的低壁滤波器。因为它可滤过血管壁的运动而显示真正的血流。它与普通阴道超声探头的区别在于图像的处理。利用彩色多普勒定位减少灰阶成像的帧率。图像显示可以大到足够以识别彩色像素的定位,同时还提供欲检部位血流波形。主要可用于了解卵巢、子宫血流状况及早期妊娠胎儿胎心搏动检查。

  显微操纵系统——细胞上“舞刀弄枪”

  除了临床诊疗,辅助生殖技术离不开实验室工作.其中最基本是许多精细操作,如卵细胞浆内单精子显微注射、植入前胚胎遗传学诊断都要在细胞或胚胎等微小构造上“舞刀弄枪”,操作过程不仅要求准确,更要保证对操作对象的不良影响达到最低。一个稳定、良好的显微系统是实验室人员顺利完成工作的坚实基础。显微系统包括操作系统和显微镜,先介绍操作系统:

  电动型操纵系统 应用历史较久,系统稳定、准确。然而,大多数的工作室使用arishige(ikon,尼康公司生产)操纵系统,该装置同时使用了电动性粗调节和液压型微调节操纵杆,优点是操纵杆和显微镜分离,在操作过程中.不会引起标本的震动。进行显微注射或胚胎活检时,液压操纵杆可以在300~400倍视野下提供灵活、平滑的位移,而且双手在台面上也能自如地控制针夹持器的升降,当使用下垂式操纵杆时,操作者的手在工作台上更舒适。该系统的缺点:由于液压管是传动的,如果发生折叠,则不能保持其位置另外,该系统便携性差,需要较多的时间安装和拆卸。

  机械型操纵系统(esearchn—strument公司生产)系统完全使用机械驱动,全部和显微镜连接,不需要额外的电40线和插座等,操纵台简洁。通过显微镜每一侧悬臂上突出向上的操纵杆来对操纵系统进行粗调节,微调节操纵杆位于悬臂下方。可以在300~400倍视野下的三维空间内进行精细运动。操纵杆定向与倒置显微镜的聚焦旋钮。系统连接以后,几乎不需要进行粗调节,系统的两侧在显微镜的载物台上都有杠杆,能够调节升降,使显微操作针在显微操作皿底部l英寸范围内移动。该系统移动方便,不用每次拆卸。缺点是操作者必须把手从工作台抬起,才能升降显微操作针,下垂式操纵杆会将手的震动转移至操作台和标本上。

  另外,还有恒温板、桌面培养箱在显微操作中用以尽量减少外界环境变化对标本细胞的影响。大多数的显微操作是注入某物质如精子或移除某物质,如卵裂球。微量注射器是进行注射或抽吸的装置。微量注射器在过去的十几年里有很大的改进,高精度、准确度达到微升的仪器,现在已经可以从生产显微操作系统的厂家购买,但价格昂贵。有两种基本的微量注射器可供选择:一种为油压(ppendorf).有连接管和显微操作针相连,靠管道内油的压力推动,另一种为气压(esearchnstrument)。管道内所装的为气体。显微操作针主要有以下几种:一种是固定针,用来固定卵子,是一种平头的微管另一种是注射针,尖端锐利,用来吸取精子以及将精子注入卵子内.也可应用抽吸针抽吸无核的碎片,或进行卵裂球活检。还有一种显微操作针可以应用于穿透或切割透明带。经常进行显微操作的中心一般都配备有一套制针设备,包括拉针仪(odel-97)、显微煅烧器(一900)、显微研磨器(一400)。

  显微镜——明察秋毫

  前已叙及,显微系统还有另外一部分,即显微镜,显微镜的种类很多,实验室常用的有倒置显微镜、相差显微镜、荧光显微镜,下面将逐一介绍:

  倒置显微镜组成和普通显微镜一样,只不过物镜与照明系统颠倒,前者在载物台之下,后者在载物台之上,用于观察培养的活细胞,具有相差物镜。观察生长在培养皿中的贴壁细胞一般都使用这种显微镜。

  相差显微镜(haseontrast1.croscope)要优于一般的光学显微镜。相差显微镜主要用于观察活细胞或未经染色细胞的形态结构。

  活细胞无色透明,细胞内各种结构间的反差很小,在一般光学显微镜下难以观察到细胞的轮廓以及内部结构,相差显微镜透过标本的可见光将相位差变成振幅差,从而提高了标本内各种结构之间的对比度,使标本中的结构清晰可辨。

  A霍夫曼调制相差(Hoffmanodu.1ationcontrast)是中常用的光学系统,这种方法允许使用塑料培养皿来观察活的标本。专用的霍夫曼物镜和霍夫曼聚光器组合在一起,可使活的、透明的标本形成一个高对比的、具有三维视觉效果的图像,而该图像不带有相差图像中的光晕。

  B干涉微分相差显微镜(ifferentialnterferencehaseontrasticroscope,),它的基本原理与相差显微镜非常相似,但它有一个装分光器的聚光器.利用分光器将光束分为两组,一组光束通过周围介质,旋转检偏器,光的干涉形成光程差,可随旋转,两光束形成不同的角度,于是被检物呈现出不同颜色,致使活细胞如同染上颜色一样。

  荧光显微镜 是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。在过程中,用于检测染色体异常的荧光探针要通过荧光显微镜才能41被观察到,此外,它也广泛运用在生殖医学科研活动中。

  显微系统所使用的光学仪器应该使操作者清晰地看到卵子和其他结构.良好的显微镜对实验室工作具有重大意义。日本Nikon是全球最大的光学仪器制造商之一。在科研、实验和生产领域尤以光学显微镜知名。美国GE、日本Olympus的光学显微镜也很有知名度。

  二氧化碳培养箱——胚胎发育的温床

  二氧化碳培养箱是作细胞、组织、细菌培养的一种先进仪器。是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备。辅助生殖技术中的研究对象均来自于人体.细胞的体外培养要求非常严格,不仅要有适合的温度、湿度,且要有洁净的气流循环。一般实验室要求二氧化碳的浓度为5%,不少公司推出多种功能、多种规格的产品,如英国RS Biotech公司最新设计的Galaxy R 二氧化碳培养箱设计了红外传感控制技术,红外传感器可编程自动调零功能,可自动校正二氧化碳传感器,直热式加热系统确保最低的污染风险。该系列成为当今市场上比较突出的品牌.多种选配件可供搭配.可以满足细胞培养的要求。另外,德国abotect公司生产适合于高要求、专业使用的二氧化碳培养箱。红外探头监测培养箱二氧化碳浓度,微处理控制,二氧化碳浓度控制稳定,不需水盘的活性湿度供给。

  现在市面上出现的三气培养箱。是指可供有氮气、二氧化碳和氧气三种气体的高级设备,原理基本同二氧化碳培养箱,但是对气体成分控制更精密。在实验室,种气体的比例通常是氮气90%、二氧化碳5%、氧气5%。此类培养箱是首先通过美国批准用于(体外授精)用途的产品,许多公司(如orma公司)的机器内置独特专利空气过滤系统,提供持续洁净的气流箱体关闭后5分钟内达到空气100级,提供理想的培养环境:具有加热功能。玻璃内门能迅速恢复箱体温度。有效防止水汽凝结:水套式培养箱能大大减少箱内温度波动,并能在断电时长时间维持箱内温度。

  总之,良好的培养箱是实验室工作的得力助手,为提供优质的配子和胚胎奠定基础。

  冷冻设备——标本存储的关键

  在辅助生殖诊疗过程中,根据患者的实际情况或要求可能需要储存配子、胚胎和卵巢组织。

  生物样品从常温降至保存温度的降温过程是样品存储成功及保持最大活性的关键,程控降温系统通过控制样品降温速率,确保样品的成功保存,广泛应用于细胞、骨髓、心脏及器官和组织移植。在辅助生育技术中,最常见的是程序化慢速冷冻法。其次是玻璃化冷冻,较少用的是超快速冷冻,后两者都属于快速冷冻的范畴。冷冻技术在不同的中心会有所不同,但是一般都可获得较好的结果。冷冻标本可以耐受一定的外界变化,只要在细胞可承受的范围之内,则细胞可以存活,发育潜能可以维持。

  程序化慢速冷冻 法要使用到程序化降温仪,又叫程序化冷冻仪。通常在程序化慢冷冻的液体中,各含有一种细胞渗透性冷冻保护剂和一种非细胞渗透性保护剂,于室温下。在低浓度的冷冻保护及溶液中预平衡,然后放置在中浓度的冷冻液中。在冷冻仪内于预设的程序下降温标本,经过冷冻保护剂的处理后.胞内渗透压增高。意味着细胞内液冰点下降。由于细胞自身的特性,它在细胞内外电解质平衡时,胞内液冰点比胞外低。英国laner公司生产各种应用范围的程序化冷冻仪.ryo360—1.7以及ryo10seriesⅡ.主要用于胚胎、配子、囊胚的冷冻保存。

  玻璃化冷冻 此法可以在没有任何昂贵的冷冻器材的情况下进行,需要的只是液氮罐。是指高浓度、极其黏稠的冷冻保护剂溶液在快速冷冻过程中,由液态直接冻结为无结构的极其黏稠的玻璃状态或无冰晶结构的固态,这种玻璃状态能保持其溶液状态的分子和离子分布。步骤一般是在高浓度的冷冻保护剂短时间平衡之后,使用最少的液体体积、采用导热性最好、管壁薄或无管壁的容器作为标本载体,直接投入液氮中,以达到最快的降温速度。是一种在较短的时间里完成冷冻程序的简单、快捷的工艺方法。与传统应用的程序冷冻相比,玻璃化冷冻能避免胚胎冻融过程中细胞内外冰晶的形成,因而目前备受重视。

  其他较少使用的一些降温方法,如快速冷冻法和超快速冷冻法,要求降湿和复温速度在慢冻和玻璃化冷冻之间。另外还可以直接冷冻:将一块较大组织(1立方毫米或更大)直接浸入一196摄氏度的液氮,组织表面的细胞被迅速冷冻结冰而死亡,而其中心部位的细胞却以相对较慢的速率降温(并可以发生脱水),组织越大,内部细胞的降温速率就越慢.里面的细胞有可能存活。

  激光打孔仪——破膜的理想设备

  前面说过,实验室有许多精细操作要完成,如胚胎活检、植入前胚胎遗传学诊断和辅助孵化等实验和研究就要借助破膜打孔设备。运用激光进行透明带打孔具有精确、简便以及非接触性等优点,它的使用可以避免化学法打孑过程中酸对胚胎的毒性,同时也可以减少机械法打孔对卵裂球细胞骨架的影响。由于激光的这些优点,目前已被广泛应用于包括辅助受精和辅助孵出等配子和胚胎的显微操作中。理想的激光系统应该易于安装。不被操作皿和操作液吸收,不会产生机械性热效应所致突变效应.目前一般认为波长为1.48微米的远红外光束能够达到这个要求。最近已有应用激光打孔进行胚胎获检面获得妊娠的报道,虽然从现有资料来看,激光打孔是安全的,但仍有不少学者担心激光打孔可能存在对卵子或胚胎的潜在热效应,因而在将其广泛应用于临床辅助透明带打孔之前,尚需进行一系列的动物实验及临床前期实验.在比较详细了解其对胚胎发育的潜在影响之后再将其用于临床。RI公司最新推出的激光破膜系统。在原有的设备基础上,经过临床实际应用,不断更新和改进。

  除了以上介绍的比较专用的仪器设备,辅助生殖技术中也要用到仪、胚胎活检针、恒温超净工作台、染色体分析软件、玻璃恒温板活细胞观测系统、专业数码相机、液氮储存设备、电穿孑仪、电融合仪、荧光免疫分析仪、精液分析仪、台式离心机、恒温试管架、水浴、杂交仪等等。值得一提的是,法国公司推出的实验室监控系统abguard2。它采用无线解决方案,对实验室重点仪器以及环境参数进行实时监控,保障安全,适用于各级医院中心。

  辅助生育技术有近三十年的历史,在早期,人们的研究主要还处于摸索阶段。集中在提高对人类配子和胚胎的认识。随着人类胚胎植入前遗传学诊断的应用范畴将更加宽广,该领域的研究也将为阐明人类胚胎的早期发育机理提供更为有效的手段,前面所介绍的几种关键设备已经在辅助生殖技术中大显身手。而未来的卵巢组织的冷冻、解冻将伴随冷冻设备的改进而日臻完善卵泡的体外培养,卵子的体外成熟,胚胎的显微操作将随着显微操作体系的完善而渐渐纯熟。这些都将为人类生育力的保存翻开新的一页。实验室系统整体水平的提高将为体细胞克隆技术的成功及其胚胎干细胞的成功建系助一臂之力,为治疗性克隆的成功开展奠定重要的基础。

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